農(nóng)林牧漁-獸醫(yī)學：非洲豬瘟的實驗室診斷技術
本著接地氣的原則，筆者嘗試著對非洲豬瘟的實驗室診斷技術，主要是熒光定量PCR技術和酶聯(lián)免疫吸附技術，展開分析討論，供ASF防控參與者一同交流。商品化試劑盒常常做為技術的載體出現(xiàn)，這里不做任何廠家試劑盒的廣告，僅從技術角度分析討論。在討論診斷技術之前，筆者提出ASF商品化試劑盒的選擇原則。
1、試劑盒選擇原則
01、敏感性比特異性更重要
去年8月3日沈陽非洲豬瘟疫情確診之前，我國并不是ASF疫區(qū)，根除非洲豬瘟病毒的過程中，診斷技術敏感性與特異性不能兼顧的情況下，敏感性比特異性顯得更加重要。用ELISA方法檢測ASFV抗體時，間接ELISA較阻斷ELISA的敏感性有優(yōu)勢。OIE官方建立的方法，也是間接ELISA（OIE Terrestrial Manual 2012; Chapter 2.8.1）。有條件的話，可以采用間接ELISA篩選，阻斷ELISA復核。
2、假陰性比假陽性危害更大
得到非洲豬瘟的實驗室檢測結(jié)果后，陽性結(jié)果必然一下子戳中神經(jīng)，震撼不已，對于陽性結(jié)果必然會進行復核。倘若是假陽性，便是虛驚一場。反而陰性結(jié)果常常直接略過，不被重視，若此結(jié)果是假陰性，那后果將是災難性的。
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真實陽性 |
真實陰性 |
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檢測陽性 |
√√√ |
× |
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檢測陰性 |
××× |
√ |
3、經(jīng)過驗證的商品化試劑盒才可信
qPCR和ELISA是非常成熟的技術，商品化試劑盒的方法建立難度不大，而用大量臨床樣品、田間樣品和標準品對商品化試劑盒驗證與質(zhì)控的過程，能夠體現(xiàn)出嚴謹?shù)目茖W態(tài)度。國內(nèi)首發(fā)非洲豬瘟疫情之前并非疫區(qū)，無法收集到陽性樣品，自主研發(fā)的商品化試劑盒的驗證存在現(xiàn)實困難。不過日前農(nóng)業(yè)部公布的兩批非瘟試劑盒應該經(jīng)過了驗證，實驗室可以放心使用。重磅！肇慶大華農(nóng)通過第二次非洲豬瘟現(xiàn)場快速檢測試劑評價
2、熒光定量PCR
筆者認為選擇經(jīng)OIE參考室驗證的商品化試劑盒用于ASF監(jiān)測排查，盡快掌握國內(nèi)ASF疫情，快速處置，對ASF根除是有利的。部分商品化試劑盒在歐非等傳統(tǒng)ASF疫區(qū)普遍使用，產(chǎn)品成熟而可靠。
若采取統(tǒng)一“度量衡”，以便于全國檢測結(jié)果數(shù)據(jù)的橫向比對。采用OIE推薦的非洲豬瘟病毒擴增p72基因分型的通用型引物（p72-D/p72-U），開展監(jiān)測排查具有現(xiàn)實可行性。導致檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果的因素很多，假陽性的原因自查后會發(fā)現(xiàn)，而如何避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，是在檢測工作開始之前需要認真考慮的事情。qPCR檢測結(jié)果的價值取決于所用試劑的質(zhì)量，除了引物以外，還需要提取試劑、預混液、對照試劑等。
筆者在這里提出幾點建議：
1、提供有效的檢測樣品是前提
《非洲豬瘟現(xiàn)場排查手冊》對樣品的采集、包裝與運輸做出了詳細說明，推薦使用“三重包裝系統(tǒng)”，運送的樣品必須附有做夠的冷卻材料（如冰袋），以防變質(zhì)。確保送達實驗室的待測樣品是有效的，是開展檢測工作的前提。實際基層采樣工作中，低溫保存和運輸是存在現(xiàn)實困難的。在這一方面OIE參考實驗室德國FLI實驗室（Friedrich-Loeffler-Institute）做了很好的嘗試，采用GenoTube拭子采樣管做為采樣工具，常溫運輸和保存送達實驗室，開展qPCR核酸檢測，ELISA和膠體金檢測卡抗體檢測。更欣喜的是FLI對非洲豬瘟的樣品采集進行了驗證。
2、建立更嚴謹而合理的檢測體系 設立內(nèi)部陽性對照（IPC） 有效預防假陰性結(jié)果出現(xiàn)
國內(nèi)獸醫(yī)實驗室qPCR檢測中會設立陰性對照和外部陽性對照，但卻很少設立內(nèi)部陽性對照（IPC）。Xeno IPC其實就是與所有物種基因組無交叉的核酸序列，被檢測樣品結(jié)果陰性，Xeno IPC檢測結(jié)果陽性（Ct值預期范圍是已知），有效證明無qPCR抑制劑存在，從而降低了假陰性結(jié)果的風險，對ASF這類重大動物疫病監(jiān)測具有重要的意義。美國獸醫(yī)實驗診斷協(xié)會（AAVLD）在實驗室指南中明確推薦Xeno IPC在qPCR檢測過程中使用。
3、選擇高品質(zhì)的核酸提取試劑和預混液
PCR檢測結(jié)果的價值取決于所用試劑的質(zhì)量。核酸提取試劑盒必須是通用型樣品制備試劑盒，可滿足實驗室對多種樣品類型檢測需求，并對全血、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體和環(huán)境樣品等進行過驗證。模塊化技術經(jīng)過專門優(yōu)化，能夠從最廣泛的樣品類型之中純化核酸，具有高簡便性、性能一致性并節(jié)省時間和成本，從而幫助提高實驗室的效率。預混液要求對酶進行優(yōu)化，以幫助鑒定那些最重要的動物病原體靶標，嚴格開發(fā)的試劑穩(wěn)定且一致，即使用于最具挑戰(zhàn)性的動物樣品，在PCR抑制劑存在的條件下也依然有效。簡單易用的預混液都能幫助獲得值得信賴的結(jié)果。
4、環(huán)境樣品的檢測結(jié)果反應生物安全防護措施是否得當
做好生物安全防護措施才能有效預防非洲豬瘟的傳入已成為共識，問題來了，如何證明生物安全防護措施是否得當？構(gòu)建完善的生物安全監(jiān)控網(wǎng)絡，有計劃的采集動物體和環(huán)境樣品進行qPCR檢測，通過客觀數(shù)據(jù)足以量化生物安全措施的防護程度。尤其是針對豬場交叉區(qū)域的出豬臺、賣豬車、無害化處理車、員工澡堂地面等區(qū)域環(huán)境樣品的檢測。
3、ELISA檢測技術
在《我國首例非洲豬瘟的確診》（王清華等）中指出，在非洲豬瘟確診的遼寧省沈陽市沈北區(qū)采集的2頭病死豬及同群30 頭臨床健康豬血清，“對32 份血清樣品的ASFV 特異性抗體檢測結(jié)果均為陰性。” 通常感染了強毒力ASFV的豬只不產(chǎn)生抗體，感染了低致病力或非致死性毒株的豬產(chǎn)生高水平的抗體。急性或最急性死亡，病死率幾乎100%是目前我國流行的非洲豬瘟疫情的顯著特點，感染豬只未產(chǎn)生ASFV抗體已經(jīng)死亡，因此很多人認為在當前疫情的情況下，開展血清學抗體檢測是無意義的，在此筆者嘗試著推敲當前疫情下ASFV抗體檢測意義。
筆者認為ELISA抗體檢測存在以下意義：
1、急性死亡的病例中也可以檢出抗體
《OIE陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》強調(diào)：“在呈地方性流行或由低毒力毒株引起的初次爆發(fā)的地方，對于新暴發(fā)病的調(diào)查研究應包括應用ELISA檢測血清或組織提取物中的特異性抗體；血清學方法在輔助確定ASF暴發(fā)時的作用不可低估，因為在急性死亡的病例中也可以檢出抗體。”
2、及時發(fā)現(xiàn)新傳入毒株或弱毒株 全面揭示ASF疫情狀況
我國首例確診非洲豬瘟病毒株為格魯吉亞毒株（Georgia 2007），病死率100%，應該屬于強毒力毒株。但同時該毒株從東歐傳入俄羅斯，又傳入遠東地區(qū)傳入中國，相比較而已，弱毒力毒株具有一定的隱蔽性，更有利于其長距離的傳播。從這一點上來看，傳入我國的ASFV格魯吉亞毒株可能也具備一定的隱蔽性。另外，已經(jīng)明確了23種基因型（Boshoof等，2007），報道的來自不同區(qū)域的毒株超過58株。其他基因型或毒株并不會靜候在國門之外，強弱毒株都有出入的風險存在。
3、及時發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒變異后引起的豬場感染
1921年非洲豬瘟在肯尼亞第一次報道，家豬的死亡率為100%（Montgomery,1921）。2010年從不同地區(qū)和宿主（家豬、疣豬、扁虱）上分離得到的11株非洲和歐洲ASFV分離株，毒力大小各不相同，在基因組水平也呈現(xiàn)顯著的遺傳差異（De Villlier等，2010）。我國養(yǎng)豬過程中疫苗免疫種類多大劑量，豬體內(nèi)抗體種類多，存在其他疫病抗體與ASFV交叉反應，以及干擾素等非特異性免疫應答的可能性，這可能導致ASFV感染豬病程增長，甚至產(chǎn)生抗體。若ASF在國內(nèi)出現(xiàn)大規(guī)模流行，也可能出現(xiàn)病毒馴化的情況。較qPCR的抗原檢測，ELISA抗體檢測能夠幫助豬場及時發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒變異后的感染。
4、及時發(fā)現(xiàn)隱性帶毒動物
家豬和野豬都是ASFV等天然宿主，其中有三種非洲野豬可以隱性帶毒，成為病毒儲存器，這三種野豬是疣豬（Phacochoerus aethiopicus）、大林豬（Hylochoerus meinertzhageni）和非洲野豬（Potamochoerus porcus）（De Tray，1957）。我國除了野豬，還有眾多的地方豬品種，很有可能存在眾多對來勢洶洶的ASFV不當回事，隱性帶毒的動物存在。這一問題如果不能及時發(fā)現(xiàn)，后患無窮。
綜上所述，我認為ASFV抗體檢測的意義在于：抗體陽性結(jié)果具有明確的診斷意義，抗體陰性結(jié)果不能說明任何問題，需正確看待。抗體檢測在當前會為我們揭示更全面的ASF疫情，在ASF根除過程中幫助我們及時發(fā)現(xiàn)疫情的變化。
目前進口的商品化ELISA抗體檢測試劑盒并不多，以下品牌的ELISA試劑盒都經(jīng)歐盟非洲豬瘟參考實驗室（同時也是OIE和FAO非洲豬瘟參考實驗室）西班牙CISA-INIA實驗室驗證，可以查詢對應的驗證結(jié)果，可網(wǎng)上自行查詢選擇。
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制造商 |
技術類型 |
包被抗原 |
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立陶宛 LT Biotech |
間接ELISA |
p22 |
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法國 IDVET |
間接ELISA |
重組蛋白 |
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瑞典 SVANOVA |
間接ELISA |
p30 |
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西班牙 INGENASA |
阻斷ELISA |
p72 |
CISA-INIA指出，在ASF呈地方流行的區(qū)域，確診可疑病例最好用標準的血清學試驗（ELISA），結(jié)合另一種血清學試驗（IFA）或抗原檢測試驗（FAT）。在有些國家，95%以上的陽性病例用IFA和FAT結(jié)合方法鑒定。IFA和FAT技術目前在國內(nèi)獸醫(yī)實驗室普及度很低，建議多結(jié)合qPCR核酸檢測結(jié)果診斷。（資料來源：獸醫(yī)獸診斷試劑）
以上就是100唯爾(100vr.com)小編為您介紹的關于非洲豬瘟的知識技巧了，學習以上的農(nóng)林牧漁-獸醫(yī)學：非洲豬瘟的實驗室診斷技術知識，對于非洲豬瘟的幫助都是非常大的，這也是新手學習農(nóng)林牧漁所需要注意的地方。如果使用100唯爾還有什么問題可以點擊右側(cè)人工服務，我們會有專業(yè)的人士來為您解答。
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